В лабораториях, занимающихся доклиническими исследованиями, необходимо проводить:


Контроль качества лабораторных животных

Контроль качества лабораторных животных осуществляется путём оценки процедур обращения с животными, касающихся размещения, питания, физического обращения, ухода и состояние их здоровья. В организации должны быть приняты стандартные правила обращения с животными:

  • все новые животные, полученные из внешних источников, должны быть изолированы и пройти процедуру карантина согласно ветеринарным требованиям;
  • на начало проведения доклинических испытаний все животные должны быть здоровыми и не являться носителями агентов, способных повлиять на результаты исследования. Если в ходе экспери мента животное заболело или стало носителем какого-либо агента, его необходимо изолировать. Данные животные могут получать лечение, если оно не повлияет на результаты исследования. Результаты диагностики, назначенное лечение и его описание, а также даты проведения лечения должны быть документированы и сохранены;
  • вся информация, необходимая для идентификации особи, размещенной вместе с другими животными, должна быть доступна в местах содержания этих животных;
  • при необходимости животных различных видов содержат в разных помещениях. Животные одного вида, но участвующие в различных экспериментах, обычно также содержатся в разных помещениях во избежание искажения результатов эксперимента. Если же их смешение необходимо, должны быть приняты меры для их адекватной дифференциации;
  • клетки, стеллажи и дополнительное оборудование должны очищаться и стерилизоваться с достаточной периодичностью;
  • вода и корм для животных должны периодически проверяться для того, чтобы удостовериться, что уровень их естественного загрязнения не превышает показателей, определенных в протоколе, выше которых загрязнение может повлиять на результаты эксперимента. О результатах проверки должны проводиться записи;
  • подстилки, находящиеся в клетках и загонах, не должны влиять на результаты исследования. Менять их нужно по мере необходимости для обеспечения животному сухости и чистоты;
  • если используются какие-либо препараты против паразитов, об этом необходимо делать запись в журнал. Препараты, способные повлиять на результаты исследования, не используются.

Микробиологический статус

Микробиологический статус животного может оказывать существенное влияние на результаты экспериментов. Агенты, в обычных условиях не вызывающие заболеваний, могут вызвать проблемы в ходе проведения эксперимента из-за стресса, испытываемого животными. Другие агенты, например такие как лактатдегидрогеназа вируса мышей, могут не вызвать заболевания в процессе эксперимента, но исказить его результаты. Учитывая это, желательно использовать как можно более «чистых» лабораторных животных, с известным микробиологическим статусом.

Диагностику и микробиологический мониторинг необходимо проводить периодически для подтверждения неизменности микробиологического статуса животного или группы животных по сравнению с ожидаемыми показателями. Для этого берутся пробы у животных, отобранных из общей популяции случайным образом. Полученные пробы обследуют на наличие патогенных вирусов, бактерий и паразитов с помощью методов ПЦР, посева флоры на питательных средах, серологических и микроскопических исследований.

Для проведения микробиологического контроля могут применяться различные методики.

  1. Использование животных-«индикаторов» с известным микробиологическим статусом. Для этого животных помещают в ту же окружающую среду, в которой находится проверяемая популяция, и периодически их умерщвляют и обследуют. Бестимусные иммунодефицитные мыши являются прекрасными индикаторами, поскольку они особенно подвержены воздействию патогенов. Однако, они не подходят для обнаружения изменений в серологическом титре, который может указывать на наличие вирусов, поскольку антигенный ответ у голых мышей отсутствует. Для определения серологического титра необходимо использовать животных с соответствующим иммунным статусом.
  2. Выборка животных из популяции. Для этого проводят общее посмертное, микробиологическое и гистологическое обследование, выявление паразитов и т.д. Количество животных, у которых необходимо взять пробы для микробиологического контроля, зависит от уровня инфицирования популяции. Если показатель инфицирования превышает 50%, для обнаружения возбудителя достаточно взять анализы у нескольких животных, но если уровень инфицирования ниже 20%, возбудителя можно найти, только обследовав, как минимум, 20 особей. В случае, если искомые патогены обладают средними и высокими показателями инфицирования 20–50%, способными повлиять на результаты исследования, достаточно обследовать 10 особей. Контроль популяции животных рекомендуется проводить каждые 2–3 месяца, поскольку высокий уровень антител в организме животного сохраняется в течение нескольких месяцев после инфицирования.
  3. Плановая проверка животных, которые умерли или были умерщвлены, включая особей, использовавшихся для экспериментов. Такая проверка позволит обнаружить инфекции или повреждения, угрожающие здоровью колонии и качеству проводимых экспериментов.

Бактериологические исследования проводятся культуральными методами с использованием дифференциальных и обогащенных питательных сред с последующей биохимической идентификацией бактерий и серологическим типированием. Среди паразитарных болезней можно выделить болезни, вызываемые клещами, гельминтами, простейшими и грибами. Данные заболевания относятся к антропозоонозам. Методы обнаружения эктопаразитов включают макроскопический осмотр, прямой стереомикроскопический осмотр, микроскопия соскобов кожи, идентификация обнаруженных паразитов. Методы исследования на наличие эндопаразитов включают полное вскрытие животного, макроскопический осмотр вскрытых органов и их содержимого, микроскопию нативных препаратов, метод декантирования, флотации, метод приготовления постоянно окрашенных препаратов и их микроскопию, идентификацию паразитов.


Генетический профиль

Генетический профиль лабораторных животных может быть крайне важным для успеха эксперимента. Учреждения, занимающиеся лабораторным животноводством, должны уделять особое внимание генетической чистоте животных. В рамках этих учреждений должны действовать программы по предотвращению генетического загрязнения линий по вине человека или в результате случайного спаривания, и раннему выявлению мутаций. Каждая линия имеет особый генетический профиль, определить который можно с помощью биохимических, иммунологических и морфологических маркеров. Желательно проводить предварительный генетический контроль до начала эксперимента.

Выведение инбредных линий позволяет получить гомозиготных животных, т.е. животных однородны по генотипу. Использование инбредных животных в эксперименте позволяет получать воспроизводимые результаты и повышает эффективность и надежность биологических исследований.

Генетическая однородность животных в пределах одной инбредной линии поддерживается путем применения специальной методики разведения таких линий. Но даже при тщательном соблюдении всех правил при разведении инбредных животных существует опасность нарушения гомозиготности. Причиной этого могут быть спонтанные мутации или случайные скрещивания (генетическая контаминация). И если мутации приводят к образованию новых линий или сублинейной дивергенции, то случайное скрещивание ведет к необратимой потере гомозиготности, то есть к потере инбредного статуса и соответствующих фенотипических качеств каждого отдельно взятого животного. Опасность генетической контаминации особенно велика, когда в одном помещении содержатся несколько линий с одинаковой окраской шерсти.

Эффективным инструментом контроля генетической однородности животных инбредных линий являются ДНК-маркеры, основанные на методе полимеразной цепной реакции. Основными преимуществами таких маркеров является их высокая степень диспергированности по геному, независимость от возраста и физиологического состояния животного, а также простота, надежность и воспроизводимость лабораторных манипуляций, необходимых для выявления таких маркеров. При амплификации геномной ДНК мышей разных линий с определенными праймерами образуется уникальный для каждой линии электрофоретический спектр продуктов амплификации, характеризующий геномную конституцию. Эти данные можно использовать для мониторинга генетической стандартизации инбредных линий.

Последовательность генома мыши была опубликована в декабре 2002 г. Это имеет большое значение, так как геном мыши составляет такое же число генов, как и геном человека, причем 99% этих генов, по-видимому, идентичны, а 96% расположены в том же порядке. Это значит, что гены болезней, идентифицированные у мыши, могут быть перенесены на генную карту человека. Можно провести экспериментальные скрещивания между мышами с различными признаками, а затем очень быстро начать изучение полученного потомства. Можно получить мутантных мышей с определенными генными дефектами, фенотип которых можно потом изучать. За последние годы было получено большое количество мышей – мутантов, у которых мутации, вызывающие потерю или приобретение какой-либо функции, находились в специфических генах, представляющих интерес с точки зрения медицины. Эти так называемые «нокаут» – или «нокин»-мутанты были сконструированы методами генной инженерии. В результате мутации инактивируется один-единственный ген. Так были созданы многие полезные модели моногенных болезней, включая синдром Леш–Нихана, кистозный фиброз, β-талассемию и синдром слабой Х-хромосомы.

В других случаях с использованием антисмысловой РНК и аналогичных подходов был достигнут эффект утраты функции генов. Модель диабета была получена путем специфичной экспрессии рибозима, направленного против мРНК глюкокиназы в β-клетках поджелудочной железы мыши. Болезнями, вызываемыми доминантными мутациями, приводящими к приобретению функции, могут быть моделированы просто переносом гена с эквивалентной мутацией в геном мыши с помощью обычных технологий переноса генов. Например, мышиные модели болезни Альцгеймера были получены суперэкспрессией гена белка – предшественника амилоида, а модель синдрома Вернера (преждевременного старения) – путем экспрессии доминантно-негативного мутанта гена WRN. Одним из первых примеров моделирования болезни, связанной с приобретением функции, – экспрессия в мышах мутантной формы прионного белка, моделирующая нейрогенеративный синдром Герштмана – Штресслера – Шейнкера (GSS).


Стандартизация линий лабораторных мышей

Широкое распространение инбредных линий мышей по лабораториям мира, а также создание новых линий потребовали разработки единых правил для их обозначения. В связи с этим был создан Международный комитет по стандартизации генетической номенклатуры мышей, куда вошли ученые разных стран. В 1952 г. Комитет впервые опубликовал правила стандартного обозначения линий мышей. Начиная с 1960 г. эти правила и списки инбредных линий мышей через каждые 4 года публикуются в журнале Cancer research.

В соответствии с рекомендацией Комитета по стандартизации инбредная линия может быть зарегистрирована как стандартная, если животных этой линии размножали братско-сестринским инбридингом не менее 20 поколений; допускается скрещивание матерей с сыновьями или отцов с дочерьми.

Обозначения инбредных линий рекомендуется писать заглавными латинскими буквами, без снижений или повышений. При выборе символа для новой линии желательны более короткие обозначения, которые необходимо сверять с опубликованными списками линий во избежание повторений. В названии давно существующих линий мышей нет общих правил. Часто оно появлялось в ходе работы по выведению линии, складывалось из символов мутантных генов окраски (DBA–dba), обозначения масти животного и индивидуального номера (C57BL). Название некоторых новых линий представляет собой символы мутантных генов (HRS, GLF), сокращенное обозначение места выведения линии и масти (NZB- и NZW-новозеландские черные и белые) или назначения линии (YT – юрловская тестерная). В большинстве же случаев перевод обозначений линий на русский язык не имеет смысла.

Линии, происходящие от общих предков, но разделенные при передаче животных в другую лабораторию на 8–19 поколении братско-сестринского инбридинга (т.е. пока мыши еще сохраняют некоторую гетерозиготность) и поддерживаемые раздельно в течение последующих поколений, принято считать сублиниями. Сублинии, кроме того, образуются при передаче племенного материала готовой инбредной линии в другие лаборатории. В этом случае в результате мутаций при длительном раздельном размножении групп животных одной линии накапливаются генетические различия между ветвями исходной линии, приводящие к биологическим отличиям. Так, существующие в мировой коллекции четыре сублинии линии СЗН отличаются друг от друга по онкологической характеристике, пять сублиний мышей C57BL отличаются друг от друга и от исходной целым рядом биологических особенностей и гистологически несовместимы. Поэтому не менее важно соблюдение правил написания сублиний. Сублинию обозначают также латинскими буквами через косую черту после написания основной линии. Символы сублиний чаще образуются из сокращения фамилии исследователя или названия лаборатории, где сублиния поддерживается. Первая буква этого обозначения – прописная, последующие – строчные. Так, символ СВА/Са обозначает сублинию Картера (Carter) линии СВА. Линии: CC57BR/Mv, CC57W/Mv – выведены Н.Н.Медведевым (Mv). Если новая сублиния образовалась путем передачи какой-либо сублинии из одной лаборатории в другую, то старый символ сохраняется и к нему добавляется новый. Например, CBA/CaLac обозначает сублинию Kaртера, поддерживаемую в английском Центре лабораторных животных (Lac). Число или строчная буква также могут быть использованы как символы сублиний. Их положение относительно других символов отражает историческую последовательность разделения сублиний. Строчные буквы, следующие непосредственно за косой чертой, означают, что сублинии разделены до достижения полной гомозиготности. Например, обозначение сублиний C57BR/a и C57BR/cd показывает, что они разделены после девяти поколений инбридинга. Обычно число или строчные буквы не используются для обозначения сублиний, разделенных после 20 поколений инбридинга. Исключение составляют давно применяемые символы, введенные до выработки правил, например DBA/1 и DBA/2.

Совершенно необходимо в публикациях употреблять хотя бы один раз полное название линии со всеми сублинейными символами. Многие сублинии имеют хорошо установленные различия. Например, мыши сублинии CBA/J несут ген дегенерации ретины, в то время как линии СВА/Са такого гена не имеют. Эти же сублинии различаются по радиочувствительности, гистологически несовместимы между собой и отличаются по крайней мере по пяти полиморфным локусам. Обозначение инбредной линии, несущей мутантный ген, состоит из символа исходной линии, символа сублиний, следующего за ним дефиса и символа гена, набираемого курсивом. Например, BALB/cY-wal означает, что сублиния имеет рецессивную мутацию (waved alopecia). Иногда мутантный ген поддерживается в гетерозиготном состоянии, это показывают включением знака (+): C57BL/6Y-+/Wy; 129/Re-+/dy. Иногда в обозначении линии есть ряд символов, отражающих различные манипуляции, которым животные данной линии подвергались. Так, одним из эффективных способов избавления линий от носительств болезнетворных микроорганизмов является вскармливание мышат, полученних кесаревым сечением, под самками, свободными от патогенной микрофлоры, в гнотобиотическом изоляторе. Того же эффекта можно добиться пересадкой оплодотворенных яйцеклеток. В некоторых случаях применяется пересадка яичников. Сублинии, выделенные при помощи вскармливания кормилицами, обозначаются добавлением буквы «f» (от английского «fostered»). Линия, в которой была произведена пересадка яйцеклеток или яичников, аналогично обозначается добавлением букв «e» (от английского «egg») или «о» (от ova). Например, символ АеВ означает, что яйцеклетки мышей линии А были пересажены самкам мышей линии C57BL. Иногда используются составные сложные обозначения линий, подвергшихся каким-либо манипуляциям или введению гена. Порядок элементов в таком обозначении соответствует истории линии. DBA/2eB – в этом положении символ линии «2» означает, что были пересажены самкам C57BL яйцеклетки именно DBA/2. Если же символ сублинии стоит вслед за символом ее получения или введенного гена, то он означает исследователя или лабораторию, где была произведена соответствующая манипуляция. DBA/2eB/De означает, что Деринджер получил эту сублинию путем пересадки яйцеклеток мышей линии DBA/2 самкам C57BL. Инбредный возраст линии определяется количеством поколений братско-сестринского инбридинга, обозначают его буквой «F» и пишут в круглых скобках – A(F87). Если нет точных данных о количестве поколений инбридинга и известна только часть истории линии (например, только число поколений инбридинга в лаборатории, в которой эта линия поддерживается последнее время), то неизвестную часть истории линии означают знаком вопроса – 101/Н (F?+22). В последние годы разработана методика сохранения линий животных путем замораживания бластоцист мышей и хранения их при низкой тем пературе в жидком азоте. Эти бластоцисты могут затем в любое время быть имплантированы самкам после расконсервирования для восстановления линии. Эта методика начинает осваиваться центрами, поддерживающими большие коллекции линий. Учитывая перспективность данного метода сохранения коллекции линий и возможное широкое распространение в будущем, Комитет по стандартизации генетической номенклатуры уже опубликовал правила обозначения линии, подвергнувшейся этой операции. В соответствии с этими правилами сохранение линии в замороженном состоянии будет обозначаться добавлением буквы «Р» (от английского «preservation»). Если после расконсервирования эмбрион имплантирован самке матери той же линии, что и эмбрион, то других дополнений в обозначении не требуется. Если же мать другой линии, то эта линия может быть указана так же, как и в случае пересадки яйцеклеток. Таким образом, символы C57BL/6реСВА/Н обозначают, что эмбрионов мышей линии C57BL/6 хранили в законсервированном состоянии и затем вырастили в самках линии СВА/Н. Лаборатория или исследователь, хранившие линию в виде законсервированных бластоцист, могут быть указаны обычным добавлением сублинейного символа C57BL/6peCBA/HBy, означающего, что манипуляции с линией произведены Бейли (Bailey). При обозначении инбредного возраста линий в круглых скобках вместе с буквой «Р» указываются годы заморозки и расконсервирования. Например, F37+(P1975-1977)+F16 означает, что линия была законсервирована на 37-м поколении в 1975 г., хранилась до 1977 г., затем была расконсервирована и прошла еще 16 поколений инбридинга. Можно видеть, что полные обозначения линий несут много информации. Знание правил обозначения дает научному работнику, читающему статью, дополнительную информацию без нежелательного в современных статьях многословного описания и характеристик используемых объектов. Вместе с тем иногда возникает необходимость сокращения длинных обозначений. Особенно это нужно, когда речь идет о конгенных линиях, полученных скрещиванием, или о гибридах.

В соответствии с этим правилом гибриды F1AKR/J × DВА/2J будут записаны как AKD2F1. Следует обратить внимание на то, что во всех записях скрещиваний или обозначениях гибридов символ линии самки пишут на первом месте. Международным Комитетом по стандартизации номенклатуры инбредных линий [Festing, 1980, Staats, 1980] зарегистрированы следующие сублинейные символы линий, полученных в учреждениях СССР:

  • Icgn – Институт цитологии и генетики Новосибирского отделения АН СССР (ныне – Институт цитологии и генетики СО РАН),
  • Iem – Институт экспериментальной медицины АМН СССР (ныне НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург),
  • Igg – Институт общей генетики АН СССР (ныне Институт общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, Москва),
  • Kv – отделение «Крюково» Центрального питомника АМН СССР (ныне филиал «Андреевка» НЦБМТ РАМН, Московская область),
  • Mv – Медведев Н.Н. Этим символом обозначаются линии, выведенные им или полученные от него на размножение,
  • Rap – питомник «Рапполово» АМН СССР (ныне питомник «Рапполово» РАМН, Ленинградская область),
  • Sto – питомник «Столбовая» АМН СССР (ныне филиал «Столбовая» НЦБМТ РАМН, Московская область),
  • Y – Научно-исследовательская лаборатория экспериментально-биологических моделей АМН СССР (ныне Научный центр биомедицинских технологий РАМН – НЦБМТ РАМН, Московская область).

Ссылки:

1. Руководство по лабораторным животным и альтернативным моделям в биомедицинских исследованиях. Под ред. Каркищенко Н.Н., Грачева С.В. М.: Профиль -2С, 2010 г.




Последние новости
Скрининг колоректального рака улучшает показатели выживаемости
Ана­лиз ка­ла на скры­тую кровь два­жды в год яв­ля­ет­ся эф­фек­тив­ным ме­то­дом скри­нин­га ко­ло­рек­таль­но­го ра­ка (КРР) у муж­чин, но не у жен­щин. Боль­ше все­го от скри­нин­га вы­иг­ры­ва­ют муж­чи­ны с опу­хо­ля­ми ле­вой по­ло­ви­ны ки­шеч­ни­ка, пи­шут фин­ские ис­сле­до­ва­те­ли.
Трансплантация легкого увеличивает риск развития опухолей в сохраненном органе
Аме­ри­кан­ские ис­сле­до­ва­те­ли со­об­ща­ют, что у па­ци­ен­тов по­сле транс­план­та­ции од­но­го лег­ко­го зна­чи­тель­но уве­ли­чи­ва­ет­ся риск раз­ви­тия зло­ка­че­ствен­ных но­во­об­ра­зо­ва­ний в со­хра­нен­ном ор­гане.
Атезолизумаб одобрен в первой линии комбинированной химиотерапии рака лёгкого
FDA одоб­ри­ло ате­зо­ли­зу­маб (Те­цен­трик®) в ком­би­на­ции с бе­ва­ци­зу­ма­бом, па­кли­так­се­лом и кар­бо­пла­ти­ном в пер­вой ли­нии те­ра­пии боль­ных ме­та­ста­ти­че­ским неплос­ко­кле­точ­ным немел­ко­кле­точ­ным ра­ком лег­ко­го (НМРЛ) с от­сут­стви­ем му­та­ции EGFR или ALK.
Все новости
Ближайшие мероприятия





Яндекс.Метрика Яндекс.Метрика